Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей icon

Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей




НазваниеКачественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей
Дата конвертации13.04.2015
Размер67.57 Kb.
ТипАнализ
источник



КАЧЕСТВЕННЫЙ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМЫ ИЗ ДВУХ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ

В.С.Сибирцев1, А.В.Гарабаджиу2

1 Всероссийский научно-исследовательский институт метрологии им. Д.И.Менделеева, Россия, 190005, Санкт-Петербург, Московский пр., 19;

2 Санкт-Петербургский государственный технологический институт, Россия, 190013, Санкт-Петербург, Загородный пр., 49.
Аннотация. Рассматриваются возможности применения для анализа как общего количества ДНК в пробе, так и её структуры системы из двух коммерческих флуоресцентных красителей (бромида этидия и Хехста-33258), обладающих согласованными спектральными и комплексообразующими свойствами.
Анализ структуры генома и количества ДНК в пробе является актуальной проблемой во многих областях биотехнологии. Всё чаще в последнее время для её решения используются искусственно синтезируемые флуоресцентные нуклеотид–специфичные красители. К преимуществам данного метода можно отнести: его простоту, экспрессность и чувствительность к малым количествам ДНК в пробе. А к его недостаткам: не очень высокую селективность, а также достаточно малую информативность при анализе структуры ДНК в пробе.

Для устранения вышеуказанных недостатков (при сохранении достоинств метода) нами для анализа ДНК была использована система из двух широкораспространённых коммерческих красителей: этидия бромида (ЕВ, 2,7-диамино-10-этил-9-фенил-фенантридиниумбромид) и Хехста-33258 (Хт, 2-[2-(4-гидроксифенил)бензимидазол-5(6)-ил]-5(6)-(4-метилпиперазин-1-ил)бенз-имидазол) (см. схему 1), ранее применявшихся для решения подобных задач лишь по отдельности [1-6].



При этом было отмечено, что спектральные свойства рассматриваемой системы определяются взаимодействием входящих в ее состав красителей как с нуклеиновой кислотой, так и друг с другом. В частности, при сорбции на ДНК, совместно, как ЕВ, так и Хт (c длинами волн максимумов возбуждения флуоресценции в видимой области спектра: 520 и 350 нм – и эмиссии: 600 и 450 нм – соответственно; см. рис.1) между молекулами этих красителей может иметь место флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET): явление, когда при возбуждении флуоресценции Хт (донор) светиться начинают не только его молекулы, но и молекулы ЕВ, (акцептор) сорбированные на полинуклеотиде на расстоянии от молекул Хт меньшем длины волны излучения последних (см. рис.2,3); причем эффективность такого переноса зависит как от расстояния между молекулами донора и акцептора энергии, так и от размера области перекрывания спектров эмиссии донора и возбуждения флуоресценции акцептора [7-11].

Кроме того, известно, что по типу взаимодействия с полинуклеотидом Хt является внешнесвязывающимся соединением, предпочтительно специфичным к участкам двойной спирали полинуклеотида, содержащим три последовательно расположенных АТ- и одну GC- пары оснований; а EB – интеркалятором, прослаивающимся между двумя парами оснований двойной спирали полинуклеотида с некоторым предпочтением к его GC-богатым участкам, и в значительно большей степени, чем Хt, специфичным к степени суперспирализации субстрата [2-6].

Таким образом, есть основания полагать, что совместное использование данных красителей сулит дополнительные эффекты, представляющие интерес в рамках структурно-функционального изучения ДНК: вплоть до возможности экспресс–оценки степени суперспи-рализации полинуклеотида в геноме и даже длины его теломерных участков [12-15]. Для чего, в качестве одной из возможных схем анализа полинуклеотида, можно предложить, следующее.

1. Добавляем к образцу специальный буферный раствор и лизирующую смесь (для поддержания рН в системе на требуемом уровне, а также обеспечения лучшего доступа молекул красителей к ДНК) и делим его на две пробы.

2. К 1-ой пробе добавляем ЕВ и по изменению его флуоресценции (относительно фонового зна-чения – без пробы – при длинах волн возбуждения и эмиссии: 520 и 605 нм) определяем общую концентрацию ДНК в образце (СДЕ).

3. 2-ую пробу насыщаем Хt и по изменению флуоресценции последнего (при длинах волн возбуждения и эмиссии: 350 и 455 нм) также определяем общую концентрацию ДНК в образце (СДХ).

4. Затем ко 2-ой пробе добавляем ^ ЕВ (который займет на полинуклеотиде участки, ещё не связанные Хt). После чего по изменению свечения систему при длинах волн возбуждения и эмиссии: 350 и 605 нм, оцениваем эффективность флуоресцентного резонансного переноса энергии от Хt к ЕВ (К), которая должна коррелировать с числом мест на ДНК, граничных между ее АТ- и GC-богатыми областями, из которых достаточно значительная часть, очевидно, должна приходиться на теломерные участки (имеющих вид: [TTAGGG]n – для позвоночных животных и человека).

5. Вычисляем коэффициент: S=СДЕДХ, увеличение которого должно, в определенной мере, отражать уменьшение степени суперспирализации ДНК пробы.

Условий, когда величины СДЕ и СДХ будут равны, можно добиться, например, посредством предварительной обработки образца ультразвуком (для гомогенизации ДНК). В случае же измерения непосредственно нативной ДНК более адекватную информацию об общем её количестве в пробе даст, вообще говоря, величина СДЕ, хотя величина СДХ имеет большую чувствительность.

Вышеописанная схема анализа ДНК была опробована нами, в частности, на двух группах крыс по 10 особей в каждой; отобранных таким образом, что I-я группа включала в себя животных со средним возрастом – 2 месяца и весом – 140 гр, а II-я: животных со средним возрастом – 1.5 года и весом – 350 гр. В результате, нами были получены статистически достоверно (p<0.01) различающиеся величины усредненных по I-ой и II-ой группам параметров S и K: чего и следовало ожидать, поскольку с возрастом (а различия в "скорости процессов старения" для крысы и человека составляют, примерно, 20:1) состояние генетического материала в клетках должно ухудшаться, в частности, за счет уменьшения степени суперспирализации ДНК, а также длины теломерных участков генома [].

Больше информации о наших работах в этом и иных смежных направлениях можно найти на сайте: http:\\www.vs1969 r.narod.ru\indexen.htm.
ЛИТЕРАТУРА
1. Cesarone C.F., Bolognesi C., Santi L. Improved microfluorometric DNA determination in biological material using 33258 Hoechst. // Anal. Biochem. -1979. -V.100, №1. -P.188–197.

2. Morgan A.R., Lee J.S., Pulleyblank D.E., Murray N.L., Evans D.H. // Nucl. Acids Res. 1979. V.7. P.547–571.

3. Pjura P.E., Grzeskowiuk K., Dickerson R.E. // J. Mol. Biol. 1987. V.197. P.257–271.

4. Сибирцев В.С., Гарабаджиу А.В., Иванов С.Д. // Биоорган. химия. 1994. Т.20. С.650–668.

5. Haq I., Ladbury J.E., Chowdhry B.Z., Jencins T.C., Chaires J.B. Specific binding of Hoechst 33258 to the d[CGCAAATTTGCG]2 duplex: calorimetric and spectroscopic studies. // J. Mol. Biol. -1997. -V.271. -P.244–257.

6. Борисова О.Ф., Щелкина А.К., Карапетян А.Т., Суровая А.Н. // Молекуляр. биол. 1998. Т.32. С.855–862.

7. Ермолаев В.Л., Бодунов Е.Н., Свешникова Е.Б., Шахвердов Т.А. Безизлучательный перенос энергии электронного возбуждения. Л.: Наука, 1977. 311с.

8. Stryer L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. // Annu. Rev. Biochem. -1978. -V.47. -P.819–846.

9. Clegg R.M. Fluorescence resonanse energy transfer and nucleic acid. // Methods Enzymol. -1992. -V.211. -P.353–388.

10. Speiser S. // Chem. Rev. 1996. V.96. P.1953–1976.

11. Lankiewicz L., Malika J., Wiczk W. // Acta Biochimica Polonica. 1997. V.44. P.477–490.

12. Микер А.К., Коффи Д.С. // Биохимия. 1997. Т.62. С.1547–1557.

13. Куренова Е.В., Мейсон Д.М. // Биохимия. 1997. Т.62. С.1453–1466.

14. Скулачев В.П. // Биохимия. 1997. Т.62. С.1394–1399.

15. Блэкберн Е.Х. // Биохимия. 1997. Т.62. С.1400–1406.


Рис.1. Спектры флуоресцентного возбуждения (a,c) и эмиссии (в,d) красителей ЕВ (a,b) и Хt (c,d) в присутствии различных количеств ДНК тимуса теленка в буфере А, содержавшем 0.01 М NaCl, 0.01 M Na2EDTA (этилендиаминотетраацетат натрия) и 0.01 M Tris (2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиол) (pH 7.4).

Запись спектров производили на спектрофлуориметре фирмы "Hitachi" model 850 (Япония) при ширине щелей монохроматоров возбуждения и эмиссии по 3 нм, скорости сканирования – 120 нм/мин, времени отклика – 2 с и нормальном усилении ФЭУ. При этом использовали стандартные кюветы квадратного сечения с длиной оптического пути 1 см. Все использовавшиеся реактивы были получены от фирмы "Serva" (Германия).

Спектры регистрировались при фиксированных длинах волн эмиссии: 600 (а) и 450 (c) нм – и длинах волн возбуждения: 520 (b) и 350 (d) нм. Кривым 1-6 на графиках соответствуют отношения молярных концентраций CДНК/CЕВ = . СEB=8×10–6 М и СХт=1×10–6 М.



^ Рис.2. Схема FRET, происходящего между Хт и ЕВ в присутствии ДНК.

Кривыми 1 и 2 обозначены спектры флуоресцентного возбуждения (при длине волны эмиссии 450 нм) и эмиссии (при длине волны возбуждения 350 нм), регистрируемые для Хт в присутствии ДНК в видимой области спектра. Кривыми 3 и 4 обозначены спектры флуоресцентного возбуждения (при длине волны эмиссии 600 нм) и эмиссии (при длине волны возбуждения 520 нм), регистрируемые для ЕВ в присутствии ДНК в видимой области спектра. Как "IsA" обозначена область перекрывания спектров эмиссии Хт и флуоресцентного возбуждения ЕВ, в которой, собственно, и может происходить FRET, в случае когда молекулы Хт и ЕВ расположены достаточно близко друг от друга; "ex." – excitation; "em." – emission.



^ Рис.3. Спектры флуоресценции системы “Хт+ЕВ” (CЕВ/CХт=8) в присутствии различных количеств ДНК в буфере А, регистрируемые при фиксированных длинах волн эмиссии: 450 (а) и 600 (б) нм – и длинах волн возбуждения: 520 (в) и 350 (г) нм.

Кривым 1-6 соответствуют отношения молярных концентраций CДНК/CХт = 0, 5, 10, 15, 20 и 25. Как "i1" и "i2" обозначены изобестические точки, наличествующие на рис.с и рис.d, соответственно. Прочие условия измерений, реактивы и т.д. – как на рис.1.



Похожие:

Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей iconДокументы
1. /Количественный и качественный состав педработников.docx
Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей iconОтчеты классных руководителей по классу; отчеты учителей по предмету; проверка классных журналов
Цель: провести качественный анализ обученности за 4 четверть 2013-2014 учебного года во 2 – 11 классах
Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей iconПоложение о проекте «Школьная газета «На двух этажах»
В настоящее время в России идет становление новой системы образования, ориентированной на вхождение в мировое образовательное пространство....
Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей iconИсследование свойств днк-специфичных красителей индольного и бензимидазольного ряда
Сравнительное исследование свойств днк-специфичных красителей индольного и бензимидазольного ряда
Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей iconДокументы
1. /АНАЛИЗ ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ПОДСИСТЕМ СИСТЕМЫ УПРАВЛЕНИЯ.doc
Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей iconСпектральные свойства красителей бисбензимидазольного ряда при взаимодействии с ДНК

Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей icon#, А. Ю. Толмачев*, В. В. Суслов
...
Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей iconЛабораторная работа №2: Прогнозирование с помощью функций регрессии Excel
Передвинуть границу оценки в будущее по временной оси можно с помощью одной из функций регрессии Excel
Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей iconАнализ воспитательной работы муниципального общеобразовательного учреждения
...
Качественный и количественный анализ нуклеиновых кислот с помощью системы из двух флуоресцентных красителей iconКонтрольная работа №4 Вариант 1 Задание 1
Задание Выпишите отдельно и назовите формулы оксидов, кислот, оснований и солей. No2 BaCl2, H2SO4, Al2(SO4)3, NaOH. FeC feSO4, K3PO4,...
Разместите кнопку на своём сайте:
Документы


База данных защищена авторским правом ©many.kabobo.ru 2000-2014
При копировании материала обязательно указание активной ссылки открытой для индексации.
обратиться к администрации
Документы

Разработка сайта — Веб студия Адаманов